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逆转录-聚合酶链反应

来源:http://www.tjzhlbio.com/news/60.html时间:2019-10-21

逆转录-聚合酶链反应
实验原理
      逆转录-聚合酶链反应的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。
实验材料试剂仪器耗材
组织、细胞等
      RNA提取试剂、dNTP 混合物、Taq DNA聚合酶、di一链cDNA合成试剂盒等;

      离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液管、移液枪、离心管盒等。

实验步骤
一、总RNA的提取
二、cDNA di一链的合成
三、PCR
1.取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:di一链cDNA 2μl;上游引物(10 pM)2μl;下游引物(10pM)2μl;dNTP(2mM) 4μl;10×PCR buffer 5μl;Taq 酶(2u/μl)1μl;
2.加入适量的ddH2O,使总体积达50 μl。轻轻混匀,离心;
3.设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对内参(如G3PD)的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照;
4.电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果;
5.密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。
注意事项
1.在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂;
2. 为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照;
3.内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差;
其他
1.反转录酶的选择
(1) Money 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性,RNA酶H活性相对较弱。作用温度为37℃;
(2)禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。作用温度为42℃;
(3)Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在Mn2+存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构;
(4)MMLV反转录酶RNase H-突变体:名称Superscript和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
2.合成cDNA引物的选择
(1) 随机六聚体引物:当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNAdi一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
(2) Oligo(dT):是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾,此引物与其配对,仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

(3)特异性引物:特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物,若PCR反应用二种特异性引物,di一条链的合成可由与mRNA 3’端靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增

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