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琼脂糖凝胶电泳​的原理是什么

来源:http://www.tjzhlbio.com/news/15.html时间:2019-03-11

琼脂糖凝胶电泳的原理是什么
       琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA 分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品,

       其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子( ocDNA )、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA。

主要影响核酸分子泳动率的因素
1、样品的物理性状
    即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言,电荷密度愈大,泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同,所以对泳动率的影响不明显。 对线形分子来说,分子量的常用对数与泳动率成反比,用此标准样品电泳并测定其泳动率, 然后进行 DNA 分子长度(bp)的负对数——泳动距离作标准曲线图,可以用于测定未知 分子的长度大小。
    DNA 分子的空间构型对泳动率的影响很大,比如质粒分子,泳动率的大小顺序为:cDNA>IDNA>ocDNA。但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响,会出现相反的情况。
2、支持物介质
    核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质,琼脂糖是一种聚合链线性分子。 含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同,是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)在N,N,N′-四甲基乙四胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)的催化下聚合形成长链,并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺(Bis)交叉连接而成, 其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。
    琼脂糖凝胶适合分离长度100至60的分子,而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段(5bp-500bp)的分离效果很好。选择不同浓度的凝胶,可以分离不同大小范围的DNA分子。
3、电场强度
    电场强度愈大,带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压,不超过4V/cm。而对于大片段电泳,甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。 进行高压电泳时,只能使用聚丙烯酰胺凝胶。
4、缓冲液离子强度
    核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统,但它们各有利弊。TAE价格低廉,但缓冲能力低,必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时,会使DNA污染磷酸盐, 影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。
    在缓冲液中加入EDTA,可以鳌合二价离子,抑制 DNase,保护DNA。
    缓冲液pH常偏碱性或中性,此时核酸分子带负电,向正极移劢。

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